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谁能和我说下子过甲基化 肿瘤抑制基因的功能障碍，不是因为基因结构的变化，而是由于基因启动子过甲基化。子过甲基化具体过程是什么 >>>>>>>>休闲养生网回答： 抑癌基因5′端启动子区CpG岛甲基化是导致基因特别是抑癌基因失活的重要原因，基因启动子区域发生甲基化后，DNA的双螺旋结构变得更加紧密而影响解链过程，从而抑制基因的转录过程 1.2实验试剂 PCR的Faststart TaqDNA聚合酶购自Roche公司，T4连接酶、pGEM?T载体购自Promega公司，测序试剂盒购自上海申能博彩公司；所有引物均由上海生工合成。hMLH1甲基化引物上游5′? ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC?3′，下游5′? CCTCATCGTAACTACCCGCG?3′，产物124bp；去甲基化引物上游5′?TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT?3′,下游5′?ACCACCTCATC 107 ATAACTACCCACA?3′,产物118bp；RT? PCR的引物：hMLH1上游5′? GTGCTGGCAATCAGGGACCC?3′,下游5′?CACGGTTGAGGCATTGGGTAG?3′,215bp;β?actin上游5′?AAGTACTCCGTGTGGATCGG?3′,下游5? TCAAGTTGGGGGACAAAAAG ?3′，产物616bp。 1.3实验方法 1.3.1抽提组织DNA和RNA并反转cDNA 1.3.2基因组DNA的甲基化处理及MSP反应 每管加入2μl dNTP、2μl Buffer、15μl ddH2O、0.75UTaq酶混匀后加入甲基化/去甲基化引物各2μl和1μl DNA模板；预变性5min，进入35个循环：变性30s→退火30s→延伸30s，连接5min。电泳后割胶回收测序。 1.3.3RT?PCR反应条件 94℃预变性5min，进入35个循环：变性60s→退火60s→延伸60s，在第13个循环加入β?actin，最后连接5min。 1.3.4PCR产物回收测序 ① PCR产物的回收纯化:按照上海博彩公司的测序试剂盒进行PCR产物的回收测序。② 应用氯化钙法制备新鲜感受态细胞，构建PCR的重组体涂于氨苄青霉素抗性中培养，经PCR检测鉴定后阳性克隆送搏彩公司测序。 1.3.5取5×106个细胞在5% CO2、37℃的RPMI?1640培养液（含100U/ml青霉素 +100μg/ml链霉素）中培养24h后加入5?Aza?CdR 2μg/ml，2天更换一次培养液，共育8d后收割细胞，提取RNA后测定转录水平。 |