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癌症的基因治疗 自20世纪中期起，分子生物学理论与技术飞速发展，Watson等（1953年）发现DNA双螺旋结构，60年代遗传密码被破译；70年代建立DNA重组和测序技术以及癌基因与抑癌基因研究的突破；80年代对珠蛋白生成障碍性贫血（地中海贫血）基因治疗的研究和逆转录病毒载体的开发，为基因诊断和治疗提供了理论依据与技术方法。 基因治疗是指运用DNA转移来治疗甚至预防人类疾患。确切地说，它指的是遗传信息相关的特异性DNA序列的转移，是一项高度集成、综合性高难度的生物技术。基因治疗是最初是以治疗单基因遗传病为主，而现已广泛应用于肿瘤等疾病的治疗研究。休闲 居 编 辑 一、基因治疗的原理和方法 肿瘤基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使期表达此基因而获得 得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达到治疗之目的。基因治疗涉及目的基因、载体及受体细胞三方面。有效的基因治疗依赖于外源基因高效而稳定的表达。利用病毒载体介导基因转移，以其高转染率和良好的靶向性而成为肿瘤基因治疗中应用最广泛的方法，其中包括逆转录病毒、腺病毒（AV）、腺相关病毒（AAV）、单纯疱疹病毒（HSV）、痘苗病毒（VV）等载体。受体细胞分为生殖细胞细胞两类，目前仅限于体细胞、成纤维细胞、肝细胞及内皮细胞等。目前常用的基因治疗方法，可以归纳为以下两种（图19-1）：一种方法是体细胞基因治疗或称“二步基因治疗”，即将受体细胞在体外培养转移入外源基因，经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输患者体内，让外源基因表达以改善患者症状。这种方法是目前基因治疗普遍采用的方法，又称为体外法（ex vivo）。另一种方法称为“直接法基因治疗”，提指不需要细胞移植而直接将外源DNA注射至机体内，DNA可以单纯注射，也可以与辅助物如脂质体一起注射，使其在体内转录、表达而发挥治疗作用，故又称为体内法（in vivo）。体内法的基因治疗方式比体外法简单、直接、经济，疗效也比较确切，常邮的体内基因直接转移手段有病毒介导、寡核苷酸直接注射、受体介导、脂质体介导和体内基因直接注射等。此外尚有原位法（in situ）。 图19-1 基因治疗策略 左：体外法基因治疗需要从患者体内取出细胞，并以治疗基因修饰，回输表达治疗基国的修饰细胞于患者；右：体内法基因治疗是直接注射含治疗基因的载体于患者 二、基因治疗的基因策略 从理论上讲，基因治疗应有两个基本目的：一是恢复异常表达或缺失的体细胞基因的功能；另一个是引入有治疗价值的其他来源的基因。第一个目的包含的内容较广泛，如恢复肿瘤局部的抗肿瘤免疫功能，阻止异常表达的癌基因，恢复肿瘤抑制基因功能，恢复细胞周期调节基因和恢复机体对肿瘤转移的抑制等。第二个目的包括引入前药转换基因，却除或转移多药耐药基因等。因此，肿瘤的基因治疗除了干扰肿瘤细胞的生长规律，纠正其恶性表型外，尚恢复和加强肿瘤局部微环境和全身濒痪的抗肿瘤系统的功能。针对以上目的，基因治疗目前主要集中在免疫基因治疗、肿瘤抑制基因治疗和药物敏感基因治疗等方面。 图19-2 研究中的主要基因治疗途径 包括转导编码前药活化酶基因进入肿瘤细胞（HSV-TK）,将野生型p53基因引入肿瘤细胞，使正常造血干细胞表达药物抵抗蛋白（MDR），转导细胞因子基因进入宿主细胞（IL-X），制备表达免疫制激分子（GM-CSF）的肿瘤细胞疫苗 免疫基因治疗 将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫。 基因修饰肿瘤细胞“疫苗”疗法 将某些细胞因子基因如IL-2、IL-4、TNF-α、INF-γ、GM-CSF等转染肿瘤细胞，可使肿瘤细胞表达活性细胞因子。转染细胞因子基因的肿瘤细胞基体内致瘤性丧失，耐动物预接肿这种转基因肿瘤细胞后，该动物对再接种的同种肿瘤有抵抗作用。能分泌细胞因子的转基因肿瘤细胞具有肿瘤疫苗作用，成为新型的肿瘤“疫苗”。这种肿瘤疫苗的作用机制是由于细胞因子表达后，一方面促进肿瘤表达特异抗原并诱发宿 主抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞（CTL）反应；另一方面分泌的细胞因子增强CTL和其他抗癌效应细胞的作用。 基因修饰TIL的过继免疫疗法 将细胞因子导入TIL细胞中，活化后的TIL具有显著抗自身肿瘤的作用，回输体仙后有聚集于肿瘤部位的倾向，携带的抗癌免疫增强性细胞因子基因在肿瘤局部表达量增加，同时还避免全身大剂量投用IL-2、TNF-α等细胞因子所引起的严重毒副反应。目前已将TNF-α基因导入TIL，并在癌症患者中进行临床试验。 免疫增强基因疗法 是将MHC1类抗原基因经体内导入肿瘤细胞内，增加其免疫原性，有效地激活机体抗癌免疫反应，降低肿瘤细胞的致瘤性。 原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法 直接在体内原位修饰肿瘤免疫原性，诱导肿瘤特异性细胞毒反应，同时肿瘤组织的CTL可产生一种“旁观者效应”（bystander effect）,即CTL不仅可以杀伤转导基因阳性肿瘤细胞，还可以杀伤转导基因阴性肿瘤细胞，使受基因治疗的瘤灶消退时，其他未治疗的瘤灶也会消退。 免疫基基治疗是很有前途的一种治疗途径。因为它可以用体外方式，从而避免目前缺乏体内有效导入系统的局限性；同时，由于它可调动机体的免疫反应，因此具有“旁观者效应”。建立瘤苗库和利用原递呈细胞系统等也是有希望的治疗途径。 癌基因拮抗疗法 肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关，可以通地阻断癌基因的表达或恢复抑癌基因的功能来抑制肿瘤的发展或恢复其正常表型。 阻断癌基因的功能 将反义癌基因导入癌细胞中、癌基因缺失突变、引入非等位基因rev等方法阻断癌基因功能。反义癌基因实际上是人工合成的与与癌基因mRNA互补的寡核苷酸，即反义寡核苷酸（ODNs）。反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常的基因的表达，以阻断癌细胞内的异常信号传导，使癌细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡。从理论上讲，由15个核苷酸构成的反义寡核苷酸导入细胞后，即可通过碱基互补原则，封闭一个特定基因的表达。实验表明，反义的ODNs可以抑制多种癌基因，如c-myb、c-myc、c-H-ras基因等。此外还可以用反义核酸抑制某些肿瘤的自分泌生长因子，以期阻断其恶性生物学行为以达到治疗目的，如在实验研究中已得到证实的TGF-α、IGF-1等反义基因。由肿瘤发生、发展的机制十分复杂，涉及多种癌基因和抑癌基因的多步骤改变，因而难以通过拮抗某一种癌基因而完全控制肿瘤的恶性行为；其次，现有的基因转移技术尚不可能百分之百地将反义ODNs或抑制基因导入体内的每一个肿瘤细胞。 用基因替代等方法恢复和增中肿瘤抑制基因的功能 如将克隆的抑癌基因Rb、p53、p16等导入肿瘤细胞，可以逆转其恶性行为，诱导细胞“凋亡”。这类研究已从实验研究过液压到临床试验阶段，其中对p53基因的部分临床试验结果显示了其潜力。Roth等直接在瘤体内注射携公平野生型p53基因的重组腺病毒（Adp53）治疗头颈部鳞癌和非小细胞肺癌，结果绝大多数肿瘤组织可表达p53基因，肿瘤体积缩小，瘤体坏死和调亡等。由英国、法国和意大利组织的国际临床合作小组直接将野生型p53基因表达质粒注射放肝癌瘤体内，未见明显毒副反应，8例患者中有1例完全缓解达19个月，3例肿瘤体明显缩小，此外还有报道称，将细胞周期抑制基因p21wafl导入p53缺失的肿瘤，效果比转导野生型p53更好。 自杀基因疗法 一些来自病毒或细菌的基因具有某些特殊的功有，其表达产物可将原先对哺乳动物经细胞增毒或极低毒性的药物转换成毒性产物，导致这些细胞死亡。将这类基因转入靶细胞，使之对某些药物具有特别的功能，可以利用这些药物使靶细胞“自杀”。因此人们将这些基因称为“自杀基因”。这些“自杀基因”表牵产物多是能将无毒性药物前体代谢为毒性产物的酶，它们又被称为“前药转换酶基因”。 常见的“自杀基因”包括胸苷激酶基因（tk基因）和胞嘧啶脱氨酶基因（CD基因）等。将这些基因导入某一细胞，通过基因重组织这些基本获得内源性表达，生长特定的酶类，这些酶可以使无素毒或低毒性前药转换成毒性产物，阻断核代谢途径，使表达这些基因的细胞对某此传真物具有特别的敏感性，最终导致这些细胞死亡。极有意义的是，此类基因更可以通过“旁观者效应”杀伤未导入基因的邻近分裂细胞，扩大其杀伤效应。如将单线纯疹病毒胞苷激酶基本（HSV-TK）导入肿瘤细胞并同时使用Acyclovir或Ganci-clovir,Acyclovir和Ganciclovir本身没有细胞毒作用，而HSV-TK产物可将Acycovir和Ganciclovir磷酸化，这些磷酸化产物具有明显的细胞毒性，能抑制细胞内DNA聚合酶的作用，从而干扰肿瘤细胞DNA合成，导致肿瘤的细胞内DNA聚合酶的作用，从而干扰肿瘤细胞DNA合成，导致肿瘤细胞死亡，正常细胞则不被伤害。这种疗法主要针对由非增殖细胞构成的肿瘤如脑细胞瘤等。人们已设计出应用HSV-TK基因治疗肿瘤的较成熟的临床试验方案，美国NIH已批准HSV-TK基因转染疗法试用于脑瘤等的临床治疗，但由于对癌旁细胞讹言春他组织（如造血细胞）的另作用以及旁观者效应，自杀基因一类的细胞毒基因如HSV-TK、CK等看来不甚理想，而且民有耐药部题，因而其适用的瘤谱是很局限的，对肝癌和造血系肿瘤必须十分慎重。脑肿瘤“自杀”基因治疗疣是目前七国唯一被正式批准的肿瘤基因治疗试验。 基因修饰配合大剂量化疗 癌症患者的癌细胞中存在着能耐受多种化疗药物的高活性多药耐药基因（MDR1），这些患者往往抵抗多种人疗药的治疗。用反义RNA或DNA灭活MDR1是提高该类患者化疗效果的有效途径。此外，将MDR1基因通过载体转移至骨髓造血干细胞，使造血系统具有抵抗化疗药物的骨髓抑制作用，提高机体对大剂量化疗的耐受力是另一种有效途径。此类研究目前还仅限于实验室。 三、基因治疗存在的关键问题 至1996年5月止，美国FDA已批准基因治疗方案130个，治疗患者900余例。其中恶性肿瘤51个方案，仅M.Bleaser的HSV-1TK/GCV治疗恶性脑瘤和Roth的p53治疗头颈部鳞癌尚有部分效果。和其他基因治疗一样，肿瘤基因治疗在实际应用过程中最大的障碍是高效、导向的载体系统和基因导入后的有效调控等。 基因导入的载体系统问题 目前所采用的载体主要分为两大类，即转染性和转导性苦载体。转染性载体是利用化学或物理方法增加细胞膜的通透性而将DNA转染入细胞内，这种方法包括脂质体和基因枪等。转导性载体则是利用病毒对细胞的天然亲和力把遗传物质引入宿主细胞。转染的方法相对简易行，抗原性弱但效率较低，而且基因表达的持久性不够。因此它在肿瘤基因治疗中的使用受到限制，也难以取得理想效果。转导法则高效、持久，但抗原性较强，目前大多数基因治疗程序仍以病毒介导。 逆转录病毒是迄今为止最为成熟、运用最广的进行基因转移的载体系统，在美国FDA批准的基因治疗计划中，超过半数是 传信息整合到细胞染色体中的能力，因而能够长期表达，而且载体可以通过建立生产细胞株大量产生。逆转录病毒载体的主要局限在于特异性低、滴度不易过浓缩提高等。近年来，国外学者力求通过新型靶向性载体及包装细胞的设计来克服其缺陷。在靶向型载体方面，包括：（1）采用带有组织特异性内部启动子，如甲胎蛋白启动子、癌胚抗原（CEA）启动子及酪到激酶启动子等构建靶向型逆转录病毒辣载体；（2）利用反式激栈活因子调节LTR启动子；（3）利用双特异分子桥，这种分子桥既可与病毒颗粒相结合，也可与特异性的细胞表面受体结合的，指导病毒粒相结合，也可与特异性的细胞表面受体结合的，指导病毒感染特异笥的靶细胞。新型包装细胞则包括靶向性载体包装细胞的设计和减少RCV的设计等。 腺病毒载体也是目前常用的载体，它具有转寻效率高，容易生产等多项优点，但它的抗原性较强，体内应用高滴度腺病毒重组体会经起对转导细胞免疫排斥及炎症反应等。为了克服腺病毒辣载体的上述缺陷，在“第二代”、“第三代”载体的基础上，“第四代”载体下在在研制中。以腺病毒相关病毒辣（AAV）为基础的载体已引起基因治疗界的重视。AAV载体具有长期稳定整合、低水平表牵 特点，且适用于表达生物活性物质的基因，在高滴度情况下也未发现引起炎症反应的副作用。它有可能弥补逆转录病毒及腺病毒的缺点而在基因治疗中起到特有的作用。AAV的主要局限是难以大量生产和载体容量有限，但新的复制模型有望解决这些问题。 基因治疗的“靶细胞”或“靶组织” 带有目的基因的载体如何到达“靶细胞”是肿瘤基因治疗的关键。只有提高基因转导的靶向性，才能实现治疗的针对性和安全性，目前国际上解决基因的靶向转移及表达有三种策略：第一种方法是以基因工程手段改造基因载体，如改造逆转录病毒包装细胞中的原病毒env序列，使所包装的重组病毒特异地识别位于靶细胞表面的抗原或受体决定簇；第二种方法是在体内基因传递系统中共价连接抗瘤抗体和肿瘤细胞特异受体的配基，使基因在类似“生物导弹”作用下被送到肿瘤细胞表面；第三种方法是应用肿瘤细胞特异蛋白“管家基因”的基因表面调控元件，在转录水平调控目的基因在靶细胞中特异表达。此外，肿瘤新生血管的内皮细胞也是一个很好的“靶”细胞及组织，国外已开始针对VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2设计反义基因或调控VEGF的基因作为目的基因，可能是一个有前景的思路。 关于外源基因在体内表达的可控性 外源基因导入后，在体人的表达若能人为调控，将对恶性肿瘤及诸多疾病的基因治疗有所突破。目前已经发现了和第一个可诱导的调控系统---TAXI/UAS系统。该系统应用一个酵母GAL4的顺式元件作为外源基因的上游，另组建一个激素受体（孕酮）及一段GAL4的反调控基因子的嵌何 体，将两个载体共转染靶细胞后，只有当诱导物（孕酮）或其拮抗物（RU486）存在时，目的基因才能表达。这是迄今唯一可诱导的调控系统，值得重视。 四、展望 目前吸瘤基因治疗的研究大多是在观察毒副反应为主的Ⅰ期临一色试验，少数地入Ⅱ/Ⅲ期临床试验，结果有待进一步驼观察。有人认为虽然目前的临床研空进程过慢，但动物实验的结果并不能完全代表人类，而临床试验具有决定性的作用。就目前的研究成果来看，基因治疗可能会在手术、放疗和化疗以外，成为一种新的肿瘤治疗手段，特别可能对提高化疗、放疗的敏感性，减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为重要的作用，成为肿瘤综合治疗中的一个较为重要的组成部分。 |